DNA-replicatie

Elke keer dat een cel zich deelt, moet elke dochtercel een volledige kopie van het genoom krijgen. Bij de mens zijn dat 2 × 3,1 miljard baseparen per cel. Die kopieerslag vindt plaats in de S-fase (synthesefase) van de interfase, vóór de mitose of meiose. Bij eukaryoten gebeurt dat in de celkern, bij bacteriën in het cytoplasma. Na de replicatie bestaat elk chromosoom uit twee identieke chromatiden.

Het basisprincipe: complementaire baseparing

Replicatie werkt doordat de twee strengen van DNA complementair zijn: tegenover A staat altijd T, tegenover G altijd C (zie DNA en genen). Ken je de ene streng, dan ligt de andere vast. Watson en Crick schreven dat in 1953 al op: de structuur ‘suggereert direct een mogelijk kopieermechanisme’.

Voorbeeld. De oude streng 3′–TACGGATC–5′ dient als mal. De nieuwe streng wordt dan 5′–ATGCCTAG–3′. Beide nieuwe moleculen hebben precies dezelfde volgorde als het origineel.

Twee dingen moet je daarbij weten. De twee strengen lopen antiparallel: de ene loopt van 5′ naar 3′, de andere van 3′ naar 5′ (de getallen verwijzen naar koolstofatomen in de suiker desoxyribose). En DNA-polymerase kan een nieuwe streng alleen in de richting 5′ → 3′ verlengen, door een nucleotide aan de vrije 3′-OH-groep te hangen. Uit die twee feiten volgt het verschil tussen de leidende en de volgende streng.

Semi-conservatief: het experiment van Meselson en Stahl

In de jaren vijftig waren er drie hypothesen. Bij conservatieve replicatie zou het oude molecuul intact blijven en een geheel nieuw molecuul ontstaan. Bij semi-conservatieve replicatie krijgt elk nieuw molecuul één oude en één nieuwe streng. Bij dispersieve replicatie zouden oude en nieuwe stukken door elkaar in beide strengen zitten.

In 1958 maakten Matthew Meselson en Franklin Stahl de keuze met een elegant experiment:

1. Ze kweekten E. coli-bacteriën vele generaties op een voedingsbodem met de zware stikstofisotoop ¹⁵N. Al hun DNA werd daardoor ‘zwaar’.
2. Daarna zetten ze de bacteriën over op een bodem met gewone, lichte ¹⁴N. Alle nieuwe DNA-strengen werden licht.
3. Na elke deling haalden ze DNA uit de bacteriën en centrifugeerden het in een oplossing van cesiumchloride. Daarin komt DNA terecht op de hoogte die past bij zijn dichtheid: zwaar DNA lager, licht DNA hoger.

Na één generatie viel conservatieve replicatie al af: er was geen zware band meer. Na twee generaties viel ook dispersieve replicatie af, want er verschenen twee aparte banden. Alleen de semi-conservatieve hypothese verklaart alle uitkomsten. Na n generaties is volgens dit model het aandeel intermediaire moleculen 2 / 2ⁿ: na 3 generaties dus 2/8 = ¼ intermediair en ¾ licht.

De stappen van de replicatie

1. Initiatie. Replicatie begint op vaste plekken, de origins of replication (replicatieoorsprongen). Een bacteriechromosoom heeft er één, een menselijk chromosoom duizenden. Daar gaat het DNA open en ontstaat een replicatiebel met aan beide kanten een replicatievork die zich van de oorsprong af beweegt.
2. Openritsen. Helicase verbreekt de waterstofbruggen tussen de baseparen. Eiwitten die aan enkelstrengs DNA binden houden de strengen uit elkaar, en topo-isomerase haalt de spanning weg die voor de vork ontstaat door het ontwinden.
3. Primer leggen. DNA-polymerase kan niet uit het niets beginnen; het heeft een vrij 3′-uiteinde nodig. Primase legt daarom eerst een kort stukje RNA (de primer) van ongeveer tien nucleotiden.
4. Verlengen. DNA-polymerase hangt nucleotiden één voor één aan de primer, telkens complementair aan de mal, in de richting 5′ → 3′.
5. Afwerken. De RNA-primers worden verwijderd en door DNA vervangen. DNA-ligase plakt de losse stukken aan elkaar tot één doorlopende streng.

De enzymen op een rij

Al deze enzymen zijn eiwitten, gecodeerd door genen in hetzelfde DNA dat ze kopiëren. De energie voor het koppelen van de nucleotiden komt uit de nucleotiden zelf: ze worden aangeleverd als trifosfaten (zoals dATP, vergelijkbaar met ATP), en bij het inbouwen komen twee fosfaatgroepen vrij.

Leidende en volgende streng; Okazaki-fragmenten

Omdat de strengen antiparallel lopen en polymerase alleen 5′ → 3′ kan bouwen, gaan de twee nieuwe strengen bij één replicatievork verschillend:

• De leidende streng (leading strand) wordt continu gemaakt. Polymerase volgt de helicase gewoon de vork in; één primer is genoeg.
• De volgende streng (lagging strand, ook ‘achterblijvende streng’) moet de andere kant op worden gebouwd, van de vork af. Hij wordt discontinu gemaakt, in stukjes. Telkens als er weer een stuk mal is vrijgekomen, legt primase een nieuwe primer en bouwt polymerase een fragment tot het vorige stuk is bereikt.

Die stukjes heten Okazaki-fragmenten, naar de Japanse onderzoekers Reiji en Tsuneko Okazaki die ze in de jaren zestig ontdekten. Bij bacteriën zijn ze 1 000 tot 2 000 nucleotiden lang, bij eukaryoten ongeveer 100 tot 200. Na verwijdering van de primers verbindt ligase ze tot één streng.

De pijlen in het schema geven de bouwrichting van de nieuwe strengen aan: de leidende streng groeit naar de vork toe, de Okazaki-fragmenten van de vork af. Oranje stukjes zijn RNA-primers.

Hoe snel gaat replicatie?

Bacterie. Bij E. coli beweegt een replicatievork met ongeveer 1 000 nucleotiden per seconde. Het chromosoom van 4,6 miljoen baseparen heeft één oorsprong en wordt door twee vorken tegelijk gekopieerd, elk de helft. Duur: 4,6 · 10⁶ / (2 × 1 000) = 2 300 s ≈ 38 minuten. Dat klopt goed met de gemeten ongeveer 40 minuten.

Mens. Bij eukaryoten gaat een vork veel langzamer, zo’n 50 nucleotiden per seconde, onder meer omdat het DNA rond histonen is gewikkeld. Zou chromosoom 1 (ongeveer 250 miljoen baseparen) maar één oorsprong hebben, dan duurde de replicatie 2,5 · 10⁸ / (2 × 50) = 2,5 · 10⁶ s ≈ 29 dagen. Doordat er in het hele genoom tienduizenden oorsprongen tegelijk of kort na elkaar actief worden, duurt de S-fase in een menselijke cel maar ongeveer 8 uur.

Foutcontrole en proofreading

DNA-polymerase zet gemiddeld ongeveer één verkeerde base per 100 000 nucleotiden. Dat zou bij een menselijke cel tienduizenden fouten per deling geven. De cel heeft daarom drie lagen controle:

Met 1 fout per 10⁹ à 10¹⁰ baseparen en 6,2 · 10⁹ baseparen per cel blijven er bij een deling gemiddeld maar enkele fouten over, en vaak geen enkele. Toch zijn het precies die zeldzame fouten die als mutaties de bron van genetische variatie vormen. Fouten in de herstelgenen zelf verhogen het risico op kanker; bij het erfelijke Lynch-syndroom werkt het mismatch-herstel minder goed.

Het eindprobleem en telomeren

Aan het uiteinde van een lineair chromosoom ontstaat een probleem. Als de laatste RNA-primer van de volgende streng wordt verwijderd, is er geen DNA-stuk meer waaraan polymerase het gat kan vullen. Bij elke deling wordt het chromosoom daardoor een stukje korter. Eukaryote chromosomen hebben daarom aan hun uiteinden telomeren: duizenden herhalingen van de volgorde TTAGGG die zelf geen genen bevatten en dus als buffer dienen. Na veel delingen (bij gekweekte menselijke cellen zo’n 50) zijn de telomeren te kort en stopt de cel met delen. Het enzym telomerase kan telomeren weer verlengen. Het is actief in stamcellen en geslachtscellen, en ook in de meeste kankercellen, waardoor die onbeperkt kunnen blijven delen. Bacteriën hebben dit probleem niet, omdat hun chromosoom rond is.

Veelgestelde vragen

Verder lezen